上期我们已经学习了细胞基本形态，细胞健康及异常状态下的特征，学会如何辨别细胞是否异常，接着从污染方面进行了深度解析。（戳此处查看原文）
但是导致细胞形态异常的罪魁祸首并不一定是污染，今天我们将从细胞培养营养体系、传代操作、培养条件、耗材等方面进行深度的剖析。
营养体系
细胞对于营养体系是有需求差异的
l 细胞名称并不能判断细胞是否好养
癌细胞只是“长生不老”，不代表它需要的营养可以降低，原代寿命短暂（分裂50-60次），但也不代表它对营养的需求高。
绝大多数细胞均可使用基础培养基+血清来养，少数细胞可以使用无血清体系培养，并且未来细胞培养体系的走势是趋向于无血清培养体系发展的。
l 细胞合适的营养体系
下面是较权威的细胞培养体系查询网站，可供大家参考。
中国菌种库：http://www.biobw.org/
血清
因为细胞所需的营养因子来自于血清，因此血清的这些事儿大家也需要了解~
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成分 |
浓度 |
成分 |
浓度 |
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蛋白和多肽 |
磷脂 |
0.7-3.0 mg/ml |
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白蛋白 |
20-50 mg/ml |
丙酮酸 |
2-10 μg/ml |
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胎球蛋白 |
10-20 mg/ml |
碳水化合物 |
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纤连蛋白 |
1-10 ug/ml |
葡萄糖 |
0.6-1.2 mg/ml |
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球蛋白 |
1-15 mg/ml |
乳酸 |
0.5-2.0 mg/ml |
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α-抗胰蛋白酶 |
0.5-2.5 mg/ml |
多胺 |
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转铁蛋白 |
2-4 mg/ml |
丁二胺,亚精胺 |
0.1-1.0 uM |
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生长因子 |
尿素 |
170-300 ug/ml |
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EGF, PDGF, IGF-I, IL-1 |
1-100 ng/ml |
无机物 |
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氨基酸 0.01-1.0 uM |
钙，氯化物，钾，磷 |
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脂质 |
激素 |
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胆固醇 |
10 uM |
胰岛素 |
1-100 ng/ml |
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脂肪酸 |
0.1-1.0 uM |
皮质醇 |
10-200 nM |
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亚油酸 |
0.01-0.1 uM |
维生素 10 ng-10 ug/ml |
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02 血清批间差
血清来源于动物，其组成成分有1000多种，且血清组成及含量常随供血动物的年龄、生理条件和营养条件而变化。因此，每个批次的组分百分比含量都是不固定的，批间差异是不可避免的。
1）血清批间差可导致细胞聚团
小鼠黑色素瘤细胞B16-F10（图源客户，仅供学习参考）
2）血清批间差可导致细胞形态改变，导致细胞失去原本该有的上皮样，成纤维样或神经母瘤样形态，边缘模糊溃烂或长角。
293T人肾上皮细胞系（图源客户，仅供学习参考）
3）血清批间差可导致胞内空泡化
03 细胞对于血清批间差敏感有以下表现：
l 新开了一瓶血清（货号没变，批号改变），复苏或传代后的细胞形态正常，增殖变慢，本来2天传的，可能要3或4天传了，可以适当加高血清比例到15%或20%（最高不能超过20%）。
l 新开了一瓶血清（货号没变，批号改变），复苏或传代后的细胞前2代还可以，然后越传越差，形态改变，增值缓慢，一般传到5，6代，细胞无法再继续传代。
l 新开了一瓶血清（货号没变，批号改变），复苏或传代后的细胞半死不活的样子，不增殖也不凋亡。
l 新开了一瓶血清（货号没变，批号改变），复苏或传代后的细胞漂浮严重，贴壁性变差，凋亡严重。
预防
建议先进行批号测试，筛选出合适批号，购买半年甚至一年以上的用量，避免批间差造成实验波动（胎牛血清在-20℃保存可达5年）。
1 ) 建议加高血清比例到15%~20%
2 ) 可购买ITS（4%胎牛血清+1%ITS+95%基础培养基）
3 ) 更换血清批次
基础培养基
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成分 |
浓度 |
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氨基酸 |
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必需氨基酸 |
苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苏氨酸和蛋氨酸（8种） |
16-146 mg/L |
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非必须氨基酸 |
丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸（12种） |
30-584 mg/L |
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无机盐 |
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二水氯化钙、Ferric nitrate、硫酸镁无水、KCl、氯化钠、无水磷酸二氢钠、碳酸氢钠 |
0.1-6400 mg/L |
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维生素 |
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氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇 |
0.4 -7.2 mg/L |
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碳水化合物 |
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葡萄糖 |
1000-4500 mg/L |
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丙酮酸钠 |
110 mg/L |
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其它 |
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酚红 |
15.9 mg/L |
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l 有的细胞用不同的基础培养基增殖效果和形态很好，没有明显差别。
l 有的细胞使用不同的培养基增殖效果都可以，但存在一种增殖速度与形态是最优的产品。
l 有的细胞可能只适合特定的基础培养基，细胞对于培养基的某种条件要求比较高（比如pH缓冲性，渗透压，微生物或葡萄糖的需求等）。
03 细胞对于基础培养基敏感表现
l 基础培养基为化学合成定量生产产品，批间差几乎不存在。
l 在未更换血清品牌及批次的前提下更换了基础培养基，可能导致细胞复苏或传代后增殖变慢，不同品牌同种培养基的浓度含量也是有差异的。
l 在未更换血清品牌及批次的前提下，培养基开封4℃下放置超过一个月，在这一个月内细胞增殖速度越来越慢，有可能是谷氨酰胺降解或二氧化碳溢出导致pH值降低，培养基偏紫，因此，建议培养基开封后一周内使用完。
04 特殊细胞对于生长因子的需求
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生长因子 |
作用 |
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成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF) |
促进成纤维细胞、平滑肌细胞增殖 |
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表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF) |
促进上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞的增殖 |
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血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） |
促进血管内皮细胞增殖 |
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白介素（Interleukin 2，IL-2） |
促进T淋巴、B淋巴、NK细胞、LAK、TIL细胞增殖 |
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重组胰岛素（Insulin, BI:01-818） |
胰岛素能刺激众多的细胞增殖与分化 |
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牛垂体提取液（BPE) |
BPE是无血清的促有丝分裂添加剂,含有天然生长因子的独特混合物,可促进上皮、干细胞等增殖 |
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氢化可的松（hydrocortisone） |
促进特定细胞增殖如人正常乳腺上皮细胞 |
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霍乱霉素（choleratoxin） |
促进特定细胞增殖如人正常乳腺上皮细胞 |
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牛血清白蛋白（BSA) |
主要用于无血清培养基中，白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用 |
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B27 |
神经细胞培养无血清添加剂，适用于大鼠海马和皮质神经元的长期培养 |
传代操作
传代过程中胰酶消化过程会影响细胞，导致出现聚团现象。
小鼠黑色素瘤细胞B16-F10（（图源客户，仅供学习参考）
复苏的原代细胞增殖良好，一旦传代就出现聚团，除图例中的，还有间充质干细胞尤其“喜欢”聚团现象。
这时需要考虑一下几点：
普通胰酶（0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA)纯度不够高，含有的杂酶，比如羧肽酶对细胞有伤害，像神经元类会比较敏感，比如小鼠海马神经元HT22。
消化不足，细胞粘连在一起，吹打时细胞成片脱落，容易聚团；
消化过度，细胞消化严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团。
吹打过猛，细胞机械损伤大，细胞聚团明显。
培养条件
哺乳动物是37℃，昆虫细胞是28℃。
通过向水盘加水，让水分蒸发，湿度达到95%。
CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养液的pH有直接关系。
耗材
培养瓶的主要成分是 polystyrene（PS），其表面是疏水的，一次性细胞培养皿等标明Tissue culture treated，是表明该器皿经过表面的改性处理，适合贴壁细胞的培养。
不止一位用户培养细胞，细胞呈现成片增殖，密度不均匀，空白地方“寸草不生”，这个时候极有可能是耗材改性处理不当或不均匀所致。
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