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各扩增酶实际上机用时总时长（包含PCR仪升温、降温过程）。
10167ES扩增3 kb片段上机时间仅需59 min！30循环下，6 kb片段上机仅需58 min！相比市面上其他产品，最高立省3.7小时！
以下更有详细实验操作解析，今日免费公开！助力实验党高效完成实验！
实验材料：
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DNA样本：大肠杆菌菌落、大肠杆菌菌液、农杆菌菌落、酵母菌落、小鼠基因组DNA、玉米基因组DNA、水稻基因组DNA。
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快速PCR试剂：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix（Cat#10167ES）。
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其他试剂：RNase-free H2O或DEPC处理水、相关基因上下游引物(储存浓度10 μM)。
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设备与耗材：移液器、PCR仪、冰盒、离心机、EP管、RNase-free离心管。
实验步骤：
01
试剂&样本前期准备
试剂解冻和混匀
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从冰箱中取出：
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从-20℃冰箱中取出含酶试剂，立即放入冰盒中（冰上操作）。
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避免将试剂直接放在室温下解冻，以免温度波动影响酶的活性。
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缓慢解冻：
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让试剂在冰上自然解冻，通常需要5-10分钟。
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如果需要快速解冻，可以将试剂握在手中轻轻摇晃，但不要过度加热。
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低速离心：
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PCR Mix在1×预混液中含有2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs，使用前要充分解冻混匀。
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将试剂管短暂离心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管盖上的液体集中到管底。
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离心后置于涡旋仪震荡10 sec混匀，确保试剂均匀分布。
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混匀后的试剂应继续放在冰上，避免长时间暴露在室温下。
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如溶解后，暂未使用，可暂时储存于4度放置。
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Tips：混匀时尽量避免产生气泡，气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。
02
模板稀释（若需要）
以下是针对不同模板，PCR反应时推荐的使用量：
用无菌超纯水稀释DNA或者线性化载体至目标浓度。
Tips：模板DNA在储存的过程中会有一定程度的降解，储存前测试的浓度不一定准确，为了保证实验精度，在放置一段时间后，需重新测试DNA模板浓度。
03
不同模板扩增1 kb目的片段比对测试
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以大肠杆菌菌落、农杆菌菌落为模板：尽量使用新鲜长满的平板，大肠杆菌、农杆菌平板4度存放不得超过45天。
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以大肠杆菌菌液为模板：使用新鲜摇菌的大肠杆菌菌液。挑取单菌落至1 mL液体培养基中，37℃摇床180 rpm培养3-4 h，至菌液浑浊但偏澄清的状态，使用分光光度计测试OD600下的菌液浓度，OD600=0.5-0.6最佳。
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Tips：OD600不宜超过1.2，菌液太浓会抑制扩增。
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以小鼠、玉米、水稻基因组DNA为模板：根据10167ES说明书中基因组添加量进行样本稀释，本实验预计添加的样本量为100 ng，将基因组DNA均稀释为50 ng/μL。
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加样顺序：RNase-free H2O＞引物＞模板＞PCR Mix。
引物作为反复冻融使用的材料，在使用过程中易造成污染，导致非特异扩增。所以建议引物作为ddH2O之后优先添加的材料，防止因枪头未更换等因素污染引物。
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菌落挑取方法：在环境中用10 μL枪头蘸取菌落后，枪头插入溶液中，移液器按钮从第一档按至第二档打出，反复吹打三次，确保菌落加入反应体系。（在透明的水中含有些微白色物质，即可确认菌落已加至反应体系中。）
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菌液加样方法：加样前需上下颠倒混匀，用200 μL枪头吹打混匀。
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PCR反应体系：
试剂混匀
配制完成后，用桌面离心机瞬离所有试剂到管底，然后涡旋10 sec振荡混匀，若期间有气泡，要将气泡轻轻指弹震裂，离心10 sec后立即上机。
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若暂时不能上机，可于-20℃暂存1 h。
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各扩增酶Mix PCR反应程序
10167ES反应程序
P*反应程序
N*反应程序
V*反应程序
T*反应程序
*推荐退火温度：60°C，也可根据自身需要设立温度梯度摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20 sec，可以在10-30 sec内调节。但需注意退火时间过长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
**延伸速度设置可参考下表：本次扩增目的片段均为1 kb左右，因此设置为1 sec/kb。
如需提高产量可适当延长延伸时间，不宜超过30 sec/kb。
***循环数可设置为30-35个循环。无需再增加循环数。因为过多的循环虽然能增加产物量，但会导致非特异性产物扩增和假阳性的风险。
Tips：随着副产物的积累以及试剂的消耗，即使再增加循环数，PCR产物量也不会再有明显增加，出现扩增无法持续的停滞现象。10167ES试剂可以抑制【扩增无法持续的停滞现象】，无需再增加循环数，即可获得高得率的PCR产物。
凝胶电泳
配制1%琼脂糖凝胶插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反应液上样（翌圣PCR试剂已含有红色示踪染料，无需添加loading buffer，可直接上样）。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES），上样4 μL。150 V电泳30 min，观察电泳条带。
Tips：移液枪斜角45°悬空插入胶孔中，缓慢加样，确保玫红色的PCR产物沉入胶孔中。避免戳破胶孔底部，导致样品渗漏。可轻微晃动电泳槽观察凝胶是否漏液。
电泳结果
注：1：大肠杆菌菌落；2：大肠杆菌菌液；3：小鼠基因组DNA；4：玉米基因组DNA；5：水稻基因组DNA；6：农杆菌菌落。
结果显示，翌圣快速PCR试剂（10167ES）性能优于市面上其他竞品，扩增速度快，检出率高，扩增产量高。
04
以酵母菌为模板扩增3 kb目的片段比对测试
样本前处理
用10 μL枪头挑取酵母菌平板上的单菌落，在装有50 μL无菌水的1.5 mL离心管中吹打三次，放入微波炉高火加热5 min，立刻用镊子夹取至-80℃冰箱冷却，即获得酵母菌前处理液。
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酵母菌前处理液可以放在4度保存7天。
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酵母菌平板在4度存放不得超过45天。
PCR加样
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加样顺序：RNase-free H2O＞引物＞酵母菌前处理液＞PCR Mix。
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菌液加样方法：尽量使用新鲜处理的酵母前处理液，加样前需解冻，震荡10 sec混匀。
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PCR反应体系：
试剂混匀
配制完成后，用桌面离心机瞬离所有试剂到管底，然后涡旋10 sec振荡混匀，若期间有气泡，要将气泡轻轻指弹震裂，离心10 sec后立即上机。
·
若暂时不能上机，可于-20℃暂存1 h。
PCR反应程序
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（同3.“各扩增酶Mix PCR反应程序”），本次扩增目的片段为3 kb左右复杂模板，因此翌圣快速PCR（Cat#10167ES）延伸速度设置为1 sec/kb。
凝胶电泳
配制1%琼脂糖凝胶插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反应液上样。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES），上样4 μL。150 V电泳30 min，观察电泳条带。
电泳结果
结果显示，翌圣快速PCR试剂（10167ES）酵母扩增性能优于市面上其他竞品，扩增速度快，检出率高，扩增产量高。
产品推荐：
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产品定位 |
名称 |
货号 |
规格 |
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快速PCR升级，可菌P且适用复杂模板扩增 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix |
1 mL/5×1 mL |
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1-7片段一步法定向连接，最快5分钟完成重组反应 |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
20 T/50 T |
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TOPO克隆-兼容TA/平末端 |
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |
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高保真PCR |
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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5 min快速完成感受态转化 |
F DH5α化学感受态 |
10×100 μL |