组蛋白翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）是染色质动态调控的核心机制之一，其种类繁多（如乙酰化、甲基化、磷酸化等），对基因表达、细胞命运和发育进程具有深远影响。近年来，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）凭借其高通量、高灵敏与高分辨的优势，已成为解析组蛋白修饰谱图的主流手段。与ChIP-seq方法相比，LC-MS/MS无需依赖抗体识别，可同时捕捉多种修饰位点及其共存组合，具备更高的系统性和定量能力。详细解析在LC-MS/MS平台上开展组蛋白修饰分析的全流程，将有效助力研究人员实现更高精度的表观遗传研究。

一、组蛋白修饰分析样本准备：提取高纯度组蛋白

1、组蛋白修饰分析中样本来源与预处理

（1）常用材料包括哺乳动物细胞系（HeLa、ES）、组织样本（肝、脑）、胚胎或类器官

（2）样本预处理应避免使用高浓度盐或去污剂，以防干扰后续色谱分离与质谱检测

2、组蛋白修饰分析中组蛋白富集方法

（1）酸提法：使用0.2 M H2SO4或0.4 N HCl处理核组分，高效释放H2A、H2B、H3、H4

（2）碱性缓冲提取：适用于同时提取组蛋白与非组蛋白核蛋白，但需注意蛋白完整性

3、组蛋白修饰分析中质量检测与定量

（1）使用SDS-PAGE或Coomassie染色确认组蛋白纯度

（2）推荐使用BCA法或NanoDrop测定蛋白浓度，确保后续酶解定量一致性

二、化学衍生与酶解：获得识别性修饰肽段

1、化学衍生保护策略

（1）常规Trypsin酶易在富含Lys/Arg的组蛋白尾部产生短肽

（2）可先对Lys进行化学衍生（如丙酰化、苯甲酰化），屏蔽酶切位点，延长肽段长度

2、多酶联合酶解

（1）GluC、ArgC、AspN等与Trypsin配合可产生覆盖更多修饰位点的肽段

（2）Bottom-up策略适合高通量修饰谱绘制；Middle-down可用于协同修饰组合解析

3、脱盐与上样准备

（1）采用C18小柱或StageTip脱盐，去除缓冲盐和干扰物

（2）肽段溶解于0.1% FA + 2% ACN中，适配nano-LC上样系统

三、LC-MS/MS分析：参数设置与检测优化

1、色谱分离设置

（1）使用纳升液相系统（nanoLC），柱长15–25 cm，粒径≤2 μm

（2）梯度洗脱通常设为90–120 min，提高肽段分辨率和峰容量

2、质谱平台选择与采集模式

（1）推荐使用Orbitrap Exploris、Fusion Lumos或Q Exactive HF等高分辨仪器

（2）采集方式多选用DDA（数据依赖采集）+ PRM（目标定量）联合策略

3、关键参数推荐

（1）MS1分辨率 ≥ 60,000，MS2 ≥ 15,000

（2）碎裂方式采用HCD（高能碰撞），保留修饰特征离子

（3）动态排除时间：20–30 s，优化低丰度修饰信号捕捉

四、组蛋白修饰分析中的数据分析：从原始谱图到修饰谱构建

1、数据库搜索与修饰定位

（1）常用软件：MaxQuant、Byonic、Proteome Discoverer等

（2）设置变量修饰（Variable Modifications）如：Acetyl[K]、Methyl[R]、Phospho[S/T]

（3）质量偏差控制：MS1 ≤ 5 ppm，MS2 ≤ 20 ppm，确保定位精度

2、定量分析策略

（1）Label-free：适合探索性实验，操作简单

（2）TMT/iTRAQ：多样本定量，适用于比较多个处理组或时间点

（3）Peak area 或 reporter ion强度用于相对定量分析

3、修饰模式解读与生物注释

（1）构建修饰热图（heatmap）、主成分分析（PCA）揭示组间差异

（2）结合GO/KEGG富集分析，理解修饰在转录调控、染色质重塑等过程中的作用

（3）与转录组/甲基化组数据联动分析，挖掘多层次调控机制

五、LC-MS/MS技术下的组蛋白修饰分析的常见挑战与解决方案

1、LC-MS/MS中低丰度修饰检测难

（1）采用多酶切策略提高修饰覆盖率

（2）结合PRM靶向检测增强低丰度位点的信噪比

2、LC-MS/MS中同位点多修饰互相干扰

（1）Middle-/Top-down策略可解析多重修饰共存模式

（2）高分辨率谱图联合人工审阅验证关键位点

3、LC-MS/MS中数据冗余与假阳性多

（1）严格设置FDR < 1%，并通过手动质谱图验证高置信肽段

（2）使用多引擎联合分析（如MaxQuant + Byonic），提升识别准确性

LC-MS/MS技术正以前所未有的分辨力揭示组蛋白修饰的时空动态。通过系统性的修饰谱分析，科研人员可在发育生物学、干细胞研究、疾病表观调控等前沿领域挖掘出更深层次的生物学规律。百泰派克生物科技将继续依托专业的质谱平台与经验丰富的技术团队，助力您的组蛋白修饰研究快速推进，从原始数据到生物发现，走得更稳、更远。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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